核苷酸的生產(chǎn)方法與高效消泡劑
發(fā)布時(shí)間：2012-10-23 15:56
桔青霉法
將喪失生成色素能力、高產(chǎn)核酸酶P1的桔青霉突變株在麩皮培養(yǎng)基上于30℃培養(yǎng)5日，然后用高效消泡劑與水抽提培養(yǎng)物。抽提液中，除含有核酸酶P1，外，還含有可將RNA經(jīng)2ˊ:3ˊ-環(huán)狀磷酸酯分解為3ˊ單核苷酸的RNase (EC3.14.23)和能把5ˊ核苷酸分解為核苷的磷酸單酯酶。然而，這些酶與核酸酶P1相比，其耐熱性很低。因此，用簡單的熱處理方法即可使之失活而除去，再添加Zn2+調(diào)整pH為5.6，在65℃反應(yīng)2h后，反應(yīng)液中便含有腺苷酸、鳥苷酸、胞苷酸和尿苷酸。
高效消泡劑中反應(yīng)液中的pH調(diào)整為8.5后，通過陰離子交換樹脂（Cl—型）的柱，然后洗脫。也可以采用磺酸陽離子交換樹脂（H+型），在pH1.5時(shí)，AMP，CMP，GMP上的氨基解離，帶正電荷，可被陽離子交換樹脂吸附。UMP沒有氨基，不帶正電荷，大部分直接流下來，不被樹脂吸附。當(dāng)用無離子水洗脫時(shí)，隨著pH值的變化，GMP, AMP上的氨基解離的程度不同，而先后失去在陽離子交換樹脂上的吸著力，按照GMP，CMP，AMP的順序洗脫下來，先收集的GMP,CMP的混合液，再用陰離子交換樹脂提純GMP。
若使AMP變?yōu)镮MP，可將含有AMP與高效消泡劑的洗脫液中和、濃縮、添加Na2HPO4使洗脫液的最后濃度為1/15 mol/L，并調(diào)整pH為5.6，加入高峰淀粉酶A和高效消泡劑，在45℃反應(yīng)2h即可。
金色鏈霉菌法
如前所述，金色鏈霉菌能產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、5'-AMP脫氨酶、5ˊ-核苷酸酶以及堿性磷酸單酯酶。在優(yōu)良的突變株中雖然提高了生產(chǎn)核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶和5ˊ-AMP脫氨酶的能力，降低了堿性磷酸單脂酶的能力，降低了堿性磷酸單酯酶的生成能力，但仍殘留很強(qiáng)的生成5ˊ-核苷酸酶的能力。為此，考慮以下幾項(xiàng)措施：
①探討最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件：除了考慮氮源種類與數(shù)量外，還有高效消泡劑，磷的作用最為強(qiáng)烈，但是磷不僅阻遏磷酸單酯酶的生成，同時(shí)也阻遏核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶的生成，這是個(gè)矛盾。其它關(guān)于溫度、高效消泡劑、pH和溶解氧都是重要的條件。
②在進(jìn)行RNA的酶解反應(yīng)之前，利用這些酶對熱穩(wěn)定性的差異，通過加熱處理，有選擇性地使5ˊ-核苷酸酶及堿性磷酸酯酶失活。
由含有這些酶的復(fù)合酶系水解RNA時(shí)，RNA是被核酸內(nèi)切酶分解成具有5ˊ-P末端的核苷酸，接著在核酸外切酶的催化下，生成5ˊ-核苷酸，而5'-AMP通過脫氨酶與高效消泡劑作用轉(zhuǎn)換成5'-IMP。同時(shí)，5ˊ-核苷酸還可以為磷酸單酯酶所催化脫去磷酸，生成核苷。如果合理地控制反應(yīng)條件，RNA則差不多定量地被分解為5ˊ-IMP, 5'-GMP,5ˊ-CMP和5'-UMP，幾乎看不到核苷酸的脫磷酸現(xiàn)象。
5ˊ-核苷酸的生產(chǎn)，還可以采用固定化酶法，即將5'-P核酸分解酶系按固定化酶制作法與載體相連，控制最適pH在酸性范圍內(nèi)，可以提高對熱的穩(wěn)定性。當(dāng)使用4%RNA與高效消泡劑在反應(yīng)塔中連續(xù)操作時(shí)，RNA的水解率在85%以上，并且AMP完全轉(zhuǎn)變?yōu)镮MP，連續(xù)操作達(dá)20多天。此外，尚可采用自溶法，由微生物自身使RNA分解成5ˊ-核苷酸。
本文參考《發(fā)酵微生物學(xué)》一書。
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