賴氨酸生產(chǎn)菌的選育與賴氨酸發(fā)酵用消泡劑
發(fā)布時間：2012-9-11 11:33
賴氨酸生產(chǎn)菌的選育，可以通過多種途徑，多數(shù)是通過幾個途徑的配合進(jìn)行選育，主要的有以下幾個方面：
切斷或減弱支路代謝
切斷支路代謝：以谷氨酸棒桿菌為出發(fā)菌株，選育和應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型突變株，切斷蘇氨酸和蛋氨酸與賴氨酸發(fā)酵用消泡劑的分支途徑，是積累賴氨酸的有效措施。賴氨酸生產(chǎn)菌以喪失HD的高絲氨酸缺陷型為主。根據(jù)變構(gòu)酶的S形動力學(xué)性質(zhì)，變構(gòu)抑制劑蘇氨酸的濃度必須在疊值以上才能與賴氨酸一起顯示對關(guān)鍵酶AK的協(xié)同反饋抑制作用。為此，只要限量蘇氨酸，將蘇氨酸的胞內(nèi)濃度控制在閾值以下，便可避開對AK的反饋抑制，積累賴氨酸。
佐野等育得的黃色短桿菌H-1 013 賴氨酸的生成量為42.6 g/L 。高絲氨酸的添加量以供菌體生長的亞適量為宜，并供給充足的發(fā)酵用消泡劑賴氨酸與生物素（30μg/L以上）。因?yàn)樯锼刎毞Γ龚?酮戊二酸轉(zhuǎn)為谷氨酸，而生物素豐富時，可以轉(zhuǎn)為形成天門冬氨酸，既可以通過草酰乙酸的轉(zhuǎn)氨作用也可以通過延胡索酸的轉(zhuǎn)化作用，天門冬氨酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為賴氨酸。
大腸桿菌的反饋抑制和谷氨酸棒桿菌不同，盡管同樣選育出高絲氨酸缺陷型，由于天門冬氨酸激酶中的三個同功酶有一個是受賴氨酸抑制和阻遏，當(dāng)賴氨酸積累時，這一同功酶不能起作用，于是削弱產(chǎn)量。更為重要的是，天門冬氨酸半醛脫氫酶受賴氨酸阻遏，要使賴氨酸過量積累，已屬不可能。 高絲氨酸缺陷型變異株對積累賴氨酸最有利，其次是蘇氨酸+蛋氨酸缺陷型與發(fā)酵用消泡劑賴氨酸，其它營養(yǎng)缺陷型例如蘇氨酸缺陷型、蛋氨酸缺陷型均不如高絲氨酸缺陷型。
變換優(yōu)先合成：優(yōu)先合成的變換會引起一種終產(chǎn)物的積累。選育高絲氨酸滲漏缺陷型和蘇氨酸敏感性突變株可以改變優(yōu)先合成，積累賴氨酸。例如，通過突變將HD的比活性降低到原來活性的1/30，可以積累20 g/L賴氨酸。選育原養(yǎng)型回復(fù)突變株與賴氨酸發(fā)酵用消泡劑的方法也能改變HD的活力，變換優(yōu)先合成。據(jù)報(bào)道，由黃色短桿菌的高絲氨酸缺陷型，經(jīng)兩次突變育得的原養(yǎng)型回復(fù)突變株S-20可產(chǎn)生23 g/L賴氨酸。經(jīng)研究確認(rèn)，S-20菌株的HD活力比變株低得多，這是高產(chǎn)的主要原因。
解除反饋調(diào)節(jié)
選育抗類似物突變株可以得到AK對反饋抑制脫敏的菌株，代謝調(diào)節(jié)被遺傳性地解除，不受培養(yǎng)基成分的影響，生產(chǎn)穩(wěn)定。這是賴氨酸發(fā)酵的重要育種手段，特別是利用賴氨酸發(fā)酵用消泡劑和營養(yǎng)缺陷型具有類似物抗性的突變株。
賴氨酸類似物的作用機(jī)制，主要是起假反饋抑制劑的作用。因?yàn)橘嚢彼犷愃莆锏慕Y(jié)構(gòu)與賴氨酸相似，易被AK所誤認(rèn)，能像賴氨酸一樣，協(xié)同蘇氨酸一起在AK的變構(gòu)部位上結(jié)合，抑制AK的活性，但這種抑制是不可逆的。倘若為AK編碼的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，使AK脫敏，不再能與類似物相結(jié)合而活性中心卻不變，就是一個抗反饋抑制的突變株。
抗類似物突變株的篩選方法：為了增強(qiáng)細(xì)菌對類似物的敏感性，可采用賴氨酸類似物十蘇氨酸或蘇氨酸類似物十賴氨酸來篩選AK脫敏的突變株。如將親株誘變處理后，在含有AEC+蘇氨酸或AHV+賴氨酸的培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)。由于誘變株的生長會把賴氨酸分泌在培養(yǎng)基中，故形成敏感株的增殖圈，選取有明顯增殖圈和賴氨酸發(fā)酵用消泡劑的抗AEC或抗AHV的突變株，作為賴氨酸發(fā)酵的試驗(yàn)株。實(shí)踐證明，利用營養(yǎng)缺陷型兼抗性或兼具有多重抗性或多缺十多抗性的突變株比單缺或單抗性菌株產(chǎn)酸率高。
本文參考《發(fā)酵微生物學(xué)》一書。
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